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蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题我们如何解决?

发布日期:2021-09-22      浏览次数:63
  蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题我们如何解决?
  1.镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
  出现这样的情况,主要是缓冲液中DTT的影响,DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与(一般的镍柱耐受小于5mMDTT,推荐缓冲液中不要超过2mMDTT)。
  2.通过His标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?
  (1)如果蛋白纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶控制剂改进。
  (2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
  (3)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
  3.镍柱堵了怎么办?
  (1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心。
  (2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入1-2mMDTT(上清样品处理要在冰浴中进行),还不行加尿素变性,使其在变形环境下。
  (3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在1/10-1/15之间较适宜。
  4.纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?
  (1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂DTT。
  (2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。
  5.如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?
  (1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶控制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
  (2)去大肠杆菌自身带(两条30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
  (3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用1M/2M/4M/8M尿素逐步溶解,可选取其中纯度较佳的。
  (4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。
  6.蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?
  (1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强)策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出较佳的洗脱条件。
  (2)降低PH的方法洗脱的,因为若PH低于3.5,会导致镍离子脱落策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
  (3)蛋白已沉淀在柱上策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变NaCl的浓度,或在变性条件下洗脱(用8M脲,或6M盐酸胍),也可在洗脱Buffer中加入2mMDTT或者0.5%肌氨酸钠进行洗脱。
  (4)非特异性疏水或其他相互反应策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%TritonX-100)或增加NaCl的浓度。
  7.没能纯化到带His标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?
  (1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放);
  策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。
  (2)样品或者是结合缓冲液不正确;
  策略:检测pH及样品和结合缓冲液的组成份(EDTA)。
  (3)组氨酸的标签没有完全的暴露;
  策略:在变性条件下(用8M脲,6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT进行纯化。
  (4)His标签丢失;
  策略1:WB或者anti-his的抗体检查His是否表达,上游构建,改变his-tag的位(C-terminalorN-terminal),必要时增加his个数(常用6-10个);
  策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;
  策略3:改变螯合的金属离子,寻找到较佳的结合金属离子。
  Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6标记的重组蛋白质的金属离子,也是一般常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可以利用HitrapIMACHP来筛选不同的金属离子。
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